荧光素酶报告基因实验

  荧光素酶报告基因实验：

    荧光素酶报告基因实验(Luciferase Reporter Gene Assay)是以荧光素(luciferin)为底物,检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。在荧光素酶的催化下，荧光素被氧化成生成氧化荧光素，发出生物荧光，继而通过荧光测定仪即可检测。利用荧光素酶与荧光素结合并发生化学发光反应的这一特性，将目的基因启动子克隆并插入到PGL3、pGL4等系列报告基因载体中，构建成荧光素酶报告质粒，转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，检测其活性，初步确定其启动子范围。在全长目的启动子报告质粒的基础上，用5’末端序列续减法，构建多个不同长度的启动子报告基因质粒。通过启动子活性差异分析，确定基因表达调控的核心区。

技术特点：

•  荧光素酶报告基因实验具有低背景、高灵敏度、可定量的细胞学分析方法；
•  荧光素酶报告基因实验是一种均质检测系统，能够快速地从一个样品中定量两个报告基因的稳定萤光信号。

应用服务：

• 通过将启动子区域序列插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转染过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性，从而验证转录因子与其调控序列间的作用；
• 分析启动子结构或SNP分析：将待研基因的启动子区域序列进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性，从而对启动子的结构或SNP进行分析。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。如将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。又如，在GPCR研究中，将cAMP response element（CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。
• 将信号通路下游响应元件序列构建如报告基因载体，从而在不同上游信号条件下，荧光素酶活性反应了下游通路的激活，从而用于检测如GPCR信号通路的激活剂或抑制剂的筛选。